A coleta pode ser efetuada durante a ascensão da temperatura em pacientes estáveis e, de preferência, antes da antibioticoterapia. Caso a paciente esteja em uso de antimicrobiano,  coletar no momento anterior à administração do medicamento. Eventualmente, hemoculturas podem ser realizadas em pacientes afebris.

- Remover os selos das tampas dos frascos de hemocultura e fazer assepsia prévia nas tampas com álcool 70%;

- Desprezar o algodão usado e deixar outro sobre a tampa até a inoculação do sangue;

- Fazer a antissepsia com clorexidina alcoólica ou álcool iodado, friccionando a pele em círculos semiabertos a partir do ponto a ser puncionado. Secar por 30 segundos. Em seguida, aplicar novamente clorexidina alcoólica utilizando novo algodão ou gaze. Esperar cerca de 30 segundos para secar, repetir o procedimento por mais uma vez e aguardar secar;

* Adultos: Colher de 10 mL em frasco específico para adultos;

* Crianças (1 ano até 6 anos): Colher de 1 a 5 mL em frasco pediátrico; 

* Neonatos até 1 ano: Coletar de 0,5 a 1,5 mL, preferencialmente superior a 1 mL por frasco; (se peso corporal Inferior a 1800 g, coletar apenas 1 amostra) em frasco pediátrico.

- Fazer a inoculação do sangue diretamente no frasco sem fazer a troca da agulha, deixando-o escoar livremente, pois os frascos para hemocultura são fechados a vácuo. Homogeneizar a amostra por inversão do frasco, duas a três vezes.

* Caso o médico solicite mais de uma amostra, este procedimento deve ser repetido de duas a três vezes, com intervalos de 30 minutos e até 1 hora entre cada coleta. Sempre que possível deve-se coletar as amostras de locais diferentes (ex: 1ª coleta: braço direito; 2ª coleta: braço esquerdo; 3ª coleta: braço direito em outra veia.  Caso exista urgência quanto ao início da antibioticoterapia colher 3 amostras ao mesmo tempo, em sítios anatômicos diferentes.

* Quando o volume de sangue coletado for fracionado em 2 frascos (para recuperação de bactérias aeróbias e anaeróbias), inocular primeiramente o frasco anaeróbio, evitando assim a entrada de oxigênio para o interior do frasco. 

Nota: O volume de sangue coletado é uma das variáveis mais críticas para a positividade do exame tanto para adultos quanto para crianças, obedecendo a quantidade de sangue exigida para cada paciente.